Doktorska disertacija
Dr Vladimir Nešić, Fakultet Veterinarske medicine Beograd, 2007.

Ispitivanje efikasnosti različitih dodataka hrani na preveniranje ili ublažavanje štetnih efekata T-2 toksina kod brojlera se odvijalo u in vitro i in vivo uslovima.

Ogled in vitro

Za in vitro ispitivanja je korišćen čist kristalni T-2 toksin, Fusarium sp., koncentracije 99%, proizvodnje Biopur, Austria. Od odabranih dodataka hrani korišćeni su:

• modifikovani klinoptilolit (neorganski adsorbent),
• esterifikovani glukomanani (organski adsorbent),
• mešoviti adsorbent (Micofix® Plus, Biomin® Austrija).

In vitro ispitivanje efikasnosti adsorbcije ili deaktivacije T-2 toksina različitim dodacima hrani je izvedeno po standardnoj proceduri koja podrazumeva dodavanje osnovnog rastvora T-2 toksina (1mg/ml u etil-acetatu) i 100 mg ispitivanih dodataka hrani. Kontakt toksina i aditiva je ostvaren na pH3 i pH7, pri temperaturi od 37 0C, u trajanju od 1h. Određivanje količine „slobodnog“ tj. nevezanog ili nerazgrađenog T-2 toksina je izvršeno tehnikom tankoslojne hromatografije (HPTLC) po proceduri koju su opisali Bata i sar. (1984).

Ogled in vivo

In vivo ispitivanja su obavljena na 160 jednodnevnih brojlerskih pilića provenijencije „Ross“, oba pola, u trajanju od 42 dana. Brojleri su hranjeni potpunim smešama: smeša za početni tov od 1. - 21. dana, smeša za porast od 22. - 35. dana i smeša za završni tov od 36. - 42. dana. Hrana je pre umešavanja T-2 toksina i aditiva ispitana na prisustvo mikotoksina (aflatoksin, ohratoksin, zearalenon i trihoteceni) u referentnoj laboratoriji.

Za pripremu kontaminirane hrane korišćen je prečišćeni izolat T-2 toksina, dobijen u laboratorijskim uslovima, kultivisanjem producentnih sojeva Fusarium sporotrichoides, od četiri izolata: ITM-496, KF-38/1, M-1-1 i R-2301. Pre umešavanja u hranu, tehnikom instrumentalne tankoslojne hromatografije (HPTLC), koja je korišćena i u in vitro ispitivanjima, određena je ukupna količina T-2 toksina u etil-acetatnom ekstraktu.

Da bi se postigla ravnomerna umešanost T-2 toksina u hrani, etil-acetatni ekstrakt, koji je sadžavao T-2 toksin u koncentraciji od 2 mg/kg hrane, je tri puta prskan po određenoj količini hrane, koja je potom bila postepeno izmešana sa preostalom količinom potrebnom za period od 1.- 21. dana eksperimenta.

Životinje korišćene u ovom eksperimentu bile su podeljene u 8 eksperimentalnih grupa, sa po 20 brojlera u svakoj grupi. Šema ogledne ishrane:

T-2 toksin i odabrani dodaci hrani bili su prisutni u ishrani brojlera u periodu od 1. do 21. dana. Od 21. dana do kraja eksperimenta 42. dana, brojleri su bili hranjeni hranom bez prisutnog T-2 toksina i odabranih dodataka hrani.

Patohistološka ispitivanja su obavljena na parafinskim isečcima debljine 3-5 μ poreklom od tankih creva, jetre i Fabricijeve burze žrtvovanih jedinki 21. i 42. dana eksperimenta. Isečci su bojeni standardnom hematoksilin-eozinom (HE) metodom i izučavani pod svetlosnim mikroskopom (Olympus BX-41).

Imunohistohemijska ispitivanja su obavljena na parafinskim isečcima tankog creva, jetre i Fabricijeve burze žrtvovanih jedinki svih grupa 21. i 42. dana eksperimenta.

Rezultati

Ustanovljene su razlike u efikasnosti testiranih aditiva u in vitro i in vivo ispitivanjima.

In vitro adsorpcija mikotoksina

Prosečne vrednosti adsorbcije ili degradacije T-2 toksina ispitivanim dodacima hrani u uslovima in vitro se nisu značajnije razlikovale u zavisnosti da li je bio umešan neorganski, organski ili mešoviti adsorbent (Micofyx plus).

In vitro adsorpcija mikotoksina

Najbolje efekte na ublažavanje negativnih posledica T-2 toksina na prirast i konverziju hrane pokazao je mešoviti adsorbent/inaktivator Micofyx plus.

Prosečne telesne mase brojlera, g

Konverzija hrane, kg

Patoanatomski nalaz

Kod 60% brojlera kontrolne grupe koji su u hrani dobijali T-2 toksin bez dodataka hrani (O-I), od 14. dana eksperimenta se konstatuje pojava tečnog izmeta i posledična zaprljanost kloake. U manjem procentu i kod jedinki II i III eksperimentalne grupe, koji su pored T-2 toksina u hrani, dobijali i neorganski (O-II), odnosno organski adsorbent (O-III), takođe je konstatovana pojava dijareje. Brojleri IV eksperimentalne grupe, kojima je pored T-2 toksina u hrani bio umešan i mešoviti adsorbent Mycofix (O-IV) su imali uobičajeno formiran feces.

Kod brojlera I eksperimentalne grupe koji su dobijali T-2 toksin bez prisutnih dodataka hrani (O-I), patoanatomskim pregledom izvršenim 21. dana, uočena je nekroza vrha jezika. Kod nekih jedinki nekroze su zabeležene i na bazi jezika u predelu frenulum linguae.

Spoljašnjim pregledom žrtvovanih brojlera kontrolne koji su dobijali T-2 toksin bez aditiva (O-I), kao i II i III eksperimentalne grupe, koji su u hrani dobijali neorganski (O-II), odnosno organski adsorbent (O-III), uočena je zaprljanost kloake neformiranim izmetom koji je bio tečne konzistencije. Unutrašnjim pregledom, kod tih jedinki u tankim crevima uočena je izražena difuzna hiperemija i bistro-tečni sadržaj sa primesama sluzi, što odgovara nalazu kataralnog enteritisa.

Na jetri brojlera kontrolne grupe, koji su dobijali T-2 toksin bez aditiva (O-I), konstatovano je prisustvo diseminovanih belih tačkica veličine 1 mm, što odgovara nalazu multifokalnih nekrotičnih žarišta. Pored nekrotičnih promena, kod nekih jedinki I eksperimentalne grupe (O-I) na jetri se zapažaju i prugasta subkapsularna krvavljenja.

Kod jedinki ostalih eksperimentalnih grupa, koje su pored T-2 toksina dobijale i dodatke hrani u cilju ublažavanja štetnih efekata T-2 toksina (O-II, O-III i O-IV), promene u usnoj duplji i na jetri nisu konstatovane.

Patohistološka i imunohistohemijska ispitivanja

Izvedenim jetre, creva i Fabricijeve burze brojlera u uslovima T-2 toksikoze, bez ili sa prisutnim dodacima hrani, omogućena je vizuelizacija suptilnijih promena, kao i proliferativne aktivnosti ćelija mukoze creva, žučnih kanala i limfocita u Fabricijevoj burzi.

Rezultati ispitivanja dobijeni u uslovima in vivo nisu u potpunosti u korelaciji sa rezultatima ispitivanja obavljenim u in vitro uslovima. Naime, i pored toga što je u uslovima in vitro stepen adsorpcije i/ili degradacije T-2 toksina od sva tri ispitivana dodatka hrani bio približno isti, kao znatno efikasniji u ublažavanju štetnih efekata T-2 toksina kod brojlera pokazao se mešoviti adsorbent (Mycofix plus).

Kratak sadržaj

Istraživanja u cilju ispitivanja efikasnosti neorganskih, organskih i mešovitih adsorbenata na preveniranje ili ublažavanje štetnih efekata T-2 toksikoze kod brojlera izvedena su u in vitro i u in vivo uslovima.

In vitro ispitivanjem određivana je količina „slobodnog“ tj. nevezanog ili nerazgrađenog T-2 toksina tehnikom tankoslojne hromatografije (HPTLC). Prosečne vrednosti adsorbcije ili degradacije T-2 toksina ispitivanim dodacima u in vitro uslovima se nisu značajnije razlikovale u zavisnosti da li je bio umešan neorganski, organski ili mešoviti adsorbens (Micofyx plus, Biomin). In vivo ispitivanja su obavljena na 160 jednodnevnih brojlerskih pilića provenijencije „Ross“, oba pola, podeljenih u 8 eksp. grupa sa po 20 jedinki u grupi. Eksperiment je trajao 42 dana, a T-2 toksin i odabrani dodaci hrani bili su, u zavisnosti od grupa, prisutni u ishrani brojlera u periodu od 1. do 21. dana. Najbolje efekte na ublažavanje negativnih posledica T-2 toksina na prirast i konverziju hrane pokazao je mešoviti adsorbent/inaktivator Micofyx plus.

Praćenjem zdravstvenog stanja, kliničke slike i proizvodnih rezultata, kod brojlera koji su dobijali u hrani umešan T-2 toksin u količini od 2 mg/kg bez ispitivanih dodataka hrani, konstatovani su karakteristični simptomi za T-2 toksikozu. Najbolji rezultati u ublažavanju štetnih efekata T-2 toksina kod brojlera dobijeni su korišćenjem mešovitog adsorbenta (Mycofix plus), dok su kod brojlera oglednih grupa kojima je u hranu bio uključen neorganski ili organski adsorbent konstatovani delimični protektivni efekti u vidu izostanka ulceracija u usnoj duplji i boljih proizvodnih rezultata u odnosu na brojlere koji su dobijali samo T-2 toksin.

Patohistološkim ispitivanjima uočeni su negativni efekti T-2 toksina u svim ispitivanim organima u vidu degenerativnih promena na sluznici usne duplje i tankog creva, nekroze enterocita i hepatocita, kao i deplecije limfocita u Fabricijevoj burzi.

Imunohistohemijskim ispitivanjima uočavaju se negativni efekti T-2 toksina na proliferativnu aktivnost ćelija mukoze creva, žučnih kanala i limfocita u Fabricijevoj burzi.

Za razliku od neorganskog i organskog adsorbenta čijom primenom nije došlo do zaštitnog efekta, u tkivnim isečcima jetre, creva i Fabricijeve burze kod brojlera koji su putem hrane dobijali T-2 toksin i mešoviti adsorbent (Mycofix plus), zapaža se uglavnom očuvana struktura ispitivanih organa.